土壌微生物の考察例｜コロニー数・CFU/g・土壌pH・含水率・誤差原因

落葉樹林の地点A、芝生の地点B、裸地の地点Cから土壌を採取し、土壌pH、含水率、培地上のコロニー数を比較した。

土壌pHは地点Aで5.8、地点Bで6.6、地点Cで7.2であった。含水率は地点Aで32.5%、地点Bで24.8%、地点Cで11.6%であった。

計数に適したプレートの平均コロニー数は、地点Aで186、地点Bで94、地点Cで142であった。

希釈倍率と接種量から算出した推定菌数は、地点Aで1.86 × 10⁷ CFU/g、地点Bで9.4 × 10⁶ CFU/g、地点Cで1.42 × 10⁶ CFU/gであった。

地点Aの推定菌数は地点Cの約13.1倍であった。

地点Aでは細菌様コロニー132、菌類様コロニー31、放線菌様コロニー23が観察され、菌類様コロニーの割合は約16.7%であった。

本実験では、落葉樹林、芝生、裸地から採取した土壌について、pH、含水率、培養可能な微生物数、コロニー形態を比較した。

地点Aの推定菌数は1.86 × 10⁷ CFU/gで、3地点中最も高かった。

地点Aは落葉樹林であり、落葉や腐植が多く、含水率も32.5%と高かった。落葉や植物根から供給される有機物は、従属栄養微生物のエネルギー源となる。

また、樹木による日陰や落葉層は土壌の乾燥を抑え、微生物が活動しやすい水分環境を維持すると考えられる。

このため、地点Aでは利用可能な有機物と水分が多く、培養可能な微生物数が増加した可能性がある。

地点AのpHは5.8で弱酸性であった。森林土壌では、落葉の分解生成物や降雨による塩基類の流亡などにより、弱酸性を示すことがある。

地点Aでは菌類様コロニーが31個認められ、割合は約16.7%であった。菌類には酸性条件や落葉などの難分解性有機物に適応したものが多く、森林土壌の有機物分解に関与している可能性がある。

地点Bの推定菌数は9.4 × 10⁶ CFU/gで、地点Aより少なく、地点Cより多かった。

地点Bは芝生であり、植物根からの分泌物や枯死根などが微生物へ有機物を供給していると考えられる。

一方、定期的な刈り込みや踏圧によって、落葉樹林より地表の有機物が少なく、土壌が締め固められていた可能性がある。

土壌の締め固めは、通気性や水分移動を低下させ、微生物群集へ影響する。そのため、地点Bの菌数が地点Aより低かったと考えられる。

地点Cの推定菌数は1.42 × 10⁶ CFU/gで最も低かった。

地点Cは植生の少ない裸地で、含水率は11.6%と低く、有機物量も少なかった。

水分は、微生物の代謝反応や栄養物質の移動に必要である。過度に乾燥した土壌では、微生物の活動や増殖が抑制される。

また、植生が少ないため、落葉や根分泌物から供給される有機物も少なかったと考えられる。

これらのことから、地点Cでは水分と有機物の不足によって、培養可能な微生物数が少なくなった可能性が高い。

地点Aの菌数は地点Cの約13.1倍であった。これは、土壌水分、有機物、植生、温度、通気性などの複数の環境要因が微生物数へ影響した結果と考えられる。

ただし、地点Cでは10⁻³希釈、地点AとBでは10⁻⁴希釈のプレートを計数に用いたため、希釈操作の誤差が地点間比較へ影響した可能性がある。

段階希釈では、各段階のわずかな容量誤差が積み重なる。特に、懸濁液を十分に混合せずに次の希釈を行うと、微生物濃度の偏りが大きくなる。

反復プレートの変動係数は地点Aで約2.7%であり、同一希釈試料における計数の再現性は比較的良好であった。

しかし、プレート間のばらつきが小さくても、採取した土壌そのものが地点全体を代表しているとは限らない。

土壌微生物は、根の周辺、落葉の下、石の周囲などに不均一に分布するため、複数地点から採取した土壌を混合して代表試料とする必要がある。

コロニー形態の観察では、乳白色で円形の細菌様コロニー、綿毛状の菌類様コロニー、乾燥して粉状の放線菌様コロニーなどが認められた。

これらの形態差は、異なる微生物群が存在する可能性を示すが、色や形だけで微生物の種を特定することはできない。

同じ種類の微生物でも培地や培養条件によって形態が変化し、異なる種類が似たコロニーを形成することもある。

したがって、本実験では「細菌様」「菌類様」「放線菌様」として記録し、種名を断定しないことが適切である。

加熱処理後にも一部のコロニーが形成された。地点Aの残存率は15.1%、地点Bは18.1%、地点Cは24.6%であった。

加熱後に残ったコロニーは、教育用条件下で処理に耐えた細胞、胞子、または処理が十分に均一でなかった部分に由来する可能性がある。

ただし、加熱処理後の残存を直ちに特定の芽胞形成菌の存在と断定することはできない。確認には、純化、顕微鏡観察、染色、生化学試験、遺伝子解析などが必要である。

今回求めたCFU/gは、培地上でコロニーを形成できた微生物の数であり、土壌中に存在する全微生物数ではない。

土壌微生物の多くは、一般培地、一定温度、短い培養期間では増殖しない。また、複数の細胞がまとまって1個のコロニーを形成する場合もある。

そのため、CFU/gは「培養可能なコロニー形成単位」の推定値として解釈する必要がある。

土壌間の比較では、含水率の違いも重要である。湿った土壌1 gには乾燥土壌の割合が少ないため、湿潤土壌基準と乾燥土壌基準では菌数が異なる。

地点Bの湿潤土壌基準の菌数9.4 × 10⁶ CFU/gを乾燥土壌基準へ補正すると、約1.25 × 10⁷ CFU/g乾土となった。

水分条件の異なる土壌を比較する場合には、乾燥土壌1 gあたりへ補正することで、より公平な比較が可能になる。

本実験では、地点Aで菌数が多く、地点Cで少なかったことから、土壌水分と有機物量が培養可能な微生物数に影響したと考えられた。

ただし、土壌pH、温度、通気性、植生、採取深度、培地選択なども影響するため、単一要因だけで菌数差を説明することはできない。

今後は、季節ごとの反復調査、複数深度からの採取、土壌有機物量や窒素量の測定、複数種類の培地、顕微鏡計数、DNA解析などを組み合わせることで、土壌微生物群集をより詳しく評価できると考えられる。

コロニーが全面に形成されて数えられなかった原因は、希釈倍率が低く、接種した微生物数が多すぎたためと考えられる。コロニーが融合すると菌数を過小評価する可能性があるため、より高い希釈段階のプレートを使用する必要がある。

コロニーが少なかった原因として、希釈倍率が高すぎた、土壌中の培養可能菌数が少なかった、懸濁が不十分だった、培養条件が適していなかった可能性がある。複数の希釈段階と対照を確認する必要がある。

反復プレート間の差が大きかった原因として、懸濁液の混合不足、土壌粒子の沈降、ピペット操作、培地上への広げ方の違いが考えられる。接種直前に試料を均一化し、同じ操作で複数プレートへ接種する必要がある。

菌類様コロニーが多かった原因として、土壌が弱酸性であったこと、落葉や木質成分などの有機物が多かったこと、比較的乾燥した条件へ適応した菌類が存在したことなどが考えられる。ただし、形態だけで菌類を確定することはできない。

pHが微生物数へ影響する一方、菌数は含水率、有機物、温度、通気性、植生などにも左右される。そのため、pHの高低とCFU/gが単純に一致しなかった可能性がある。複数の環境要因を総合して評価する必要がある。