タンパク質定量の考察例｜検量線・吸光度・濃度計算・回収率・誤差原因

Bradford法を用いて教育用タンパク質試料を定量した。標準タンパク質濃度は0～1.0 mg/mLとし、595 nmにおける吸光度を測定した。

ブランクの平均吸光度は0.040であった。標準液のブランク補正吸光度は、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mLに対して、それぞれ0.126、0.253、0.382、0.510、0.637であった。

検量線の回帰式はy = 0.638x − 0.001、決定係数はR² = 0.9999であった。

5倍希釈した試料Aの平均吸光度は0.357、ブランク補正吸光度は0.317であった。検量線から希釈試料濃度は0.498 mg/mLと求められ、原試料濃度は2.49 mg/mLであった。

試料Aの体積は4.0 mLであったため、総タンパク質量は9.96 mgであった。

試料Aの独立した3回の測定値は2.44、2.49、2.54 mg/mLで、平均2.49 mg/mL、標準偏差0.05 mg/mL、変動係数2.0%であった。

試料Dの補正吸光度は0.779であり、検量線の最大標準値0.637を上回ったため、濃度は確定せず、さらに希釈して再測定する必要があると判断した。

本実験では、Bradford法を用いて標準タンパク質溶液の検量線を作成し、未知試料のタンパク質濃度を求めた。

標準タンパク質濃度が0～1.0 mg/mLの範囲では、濃度の増加に伴って595 nmにおける吸光度も増加した。

これは、タンパク質へ結合した色素量が増加し、測定波長における吸光が強くなったためと考えられる。

ブランク吸光度は0.040であった。発色試薬や溶媒自体もわずかに吸光するため、試料の吸光度からブランク値を差し引く必要がある。

ブランク補正を行わない場合、すべての試料濃度を実際より高く見積もることになる。

検量線の回帰式はy = 0.638x − 0.001で、決定係数R²は0.9999であった。R²が1に非常に近いことから、今回の標準濃度範囲では濃度と吸光度が良好な直線関係を示したと考えられる。

ただし、R²が高いことだけで、どの濃度でも正確に定量できるわけではない。高濃度では色素量や装置の測定範囲が制限となり、吸光度の増加が濃度に比例しなくなる場合がある。

5倍希釈した試料Aの平均吸光度は0.357、ブランク補正吸光度は0.317であった。検量線へ代入すると希釈試料濃度は0.498 mg/mLとなり、希釈倍率5を掛けることで原試料濃度は2.49 mg/mLと求められた。

試料Aの体積は4.0 mLであったため、総タンパク質量は9.96 mgであった。濃度だけを比較すると試料の濃さは分かるが、試料全体に含まれる量を評価するには濃度へ体積を掛ける必要がある。

試料Bの濃度は7.01 mg/mLと試料Aより高く、総量も17.53 mgであった。これは、試料Bが高濃度であるだけでなく、一定量の試料中に多くのタンパク質を含んでいたことを示す。

試料Cの原試料濃度は0.358 mg/mLであり、他の試料より低かった。吸光度がブランクに近い低濃度試料では、わずかな測定誤差が計算濃度へ大きく影響する。

そのため、低濃度域を正確に測定する場合は、より低濃度側に標準点を追加する、試料の希釈を減らす、感度の高い定量法を使用するなどの工夫が必要である。

試料Dの補正吸光度は0.779であり、1.0 mg/mL標準液の0.637を上回った。この試料を検量線の外側まで外挿すると希釈試料濃度1.223 mg/mLと計算できるが、直線性が保証されていない範囲であるため、この値を確定値として採用すべきではない。

試料Dはさらに希釈し、吸光度を検量線の範囲内へ入れてから再測定する必要がある。

反応時間の比較では、2分後の吸光度は0.302、10分後は0.357、40分後は0.381であった。反応初期には発色が十分に進んでおらず、時間が長くなるにつれて吸光度が増加した。

試料ごとの反応時間が異なると、同じタンパク質濃度でも異なる吸光度を示す可能性がある。そのため、試薬添加から測定までの時間をそろえることが重要である。

試料Aの3回の濃度は2.44、2.49、2.54 mg/mLであり、平均2.49 mg/mL、標準偏差0.05 mg/mL、変動係数2.0%であった。

変動係数が比較的小さかったことから、ピペット操作、発色、吸光度測定には一定の再現性があったと考えられる。

一方で、標準偏差が小さくても、標準液濃度そのものが誤っていれば、すべての測定値が同じ方向へずれる系統誤差が生じる。反復測定だけでなく、標準液調製や装置校正も重要である。

精製前後の比較では、粗抽出液の総タンパク質量32.0 mgに対して、精製後は18.0 mgであり、回収率は56.3%であった。

精製後は濃度が3.20 mg/mLから4.50 mg/mLへ上昇したが、体積が10.0 mLから4.0 mLへ減少したため、総タンパク質量は低下した。

この結果は、濃度の上昇だけでは回収量が増えたとは判断できないことを示している。精製操作の評価では、濃度、体積、総量、回収率を合わせて検討する必要がある。

回収率が100%未満となった原因として、ろ過や遠心時の損失、容器表面への吸着、沈殿への残留、回収液の取り残し、精製過程での除去などが考えられる。

ただし、粗抽出液には目的タンパク質以外の多くのタンパク質も含まれるため、総タンパク質量の減少だけで精製失敗とは判断できない。目的タンパク質の活性や純度を別に評価する必要がある。

Bradford法では、タンパク質の種類によって色素との結合量が異なる。標準液と未知試料でアミノ酸組成や立体構造が大きく異なる場合、同じ質量濃度でも発色強度が異なる可能性がある。

したがって、検量線から得られる値は標準タンパク質に対する換算濃度であり、未知タンパク質の絶対濃度と完全には一致しない場合がある。

また、界面活性剤、塩、還元剤、緩衝液成分などは発色へ干渉することがある。標準液と未知試料の溶媒組成が異なると、タンパク質濃度以外の差が吸光度へ表れる可能性がある。

この影響を減らすには、標準液と試料の溶媒条件をできるだけそろえ、試料と同じ溶媒を用いたブランクを作成する必要がある。

気泡や濁りも吸光度を高くする原因となる。これらはタンパク質による吸収ではなく光散乱によるため、気泡を除去し、必要に応じて遠心やろ過を行うことが望ましい。

以上より、検量線の直線範囲内に入るよう未知試料を適切に希釈し、ブランク補正と希釈倍率補正を行うことで、試料Aのタンパク質濃度は2.49 mg/mL、総タンパク質量は9.96 mgと求められた。

タンパク質定量の信頼性を高めるには、標準液調製、反応時間、測定波長、試料希釈、ブランク組成、反復測定を統一し、検量線範囲外の値を無理に外挿しないことが重要である。

未知試料の吸光度が最高濃度標準液を上回った場合、検量線範囲外であり、直線関係が保証されない。外挿値を採用せず、試料をさらに希釈して検量線範囲内で再測定する必要がある。

試料吸光度がブランクに近かった場合、タンパク質濃度が低い、試料を希釈しすぎた、発色が不十分であった、試薬添加に誤りがあった可能性がある。低濃度側の標準点を追加し、希釈倍率や反応時間を見直す必要がある。

検量線が直線にならなかった原因として、標準液調製誤差、試薬量のばらつき、反応時間の不統一、気泡、測定範囲の超過などが考えられる。標準液を再調製し、各操作条件を統一して再測定する必要がある。

反復測定のばらつきが大きかった原因として、ピペット操作、混合不足、気泡、発色時間、ウェル間の液量差などが考えられる。各操作を同じ順序と時間で行い、適切な容量のピペットを使用する必要がある。

理論値より高い濃度となった原因として、ブランク補正の誤り、試料の濁り、気泡、希釈倍率の計算ミス、発色を促進する夾雑物の混入などが考えられる。測定液の外観と計算過程を確認する必要がある。