グラム染色の考察例｜陽性・陰性の違い・判定方法・誤差原因

安全性が確認された教育用のグラム陽性球菌、グラム陰性桿菌、および両者の混合標本についてグラム染色を行い、顕微鏡で色、形、配列を観察した。

試料Aでは、青紫色に染まる球状の菌体が主に房状に配列していたため、グラム陽性球菌と判定した。

試料Bでは、桃赤色に染まる短い桿状の菌体が単在または短い連鎖として認められたため、グラム陰性桿菌と判定した。

混合標本Cでは、青紫色の球菌と桃赤色の短桿菌が同一標本内に認められた。10視野で計数した結果、紫色球菌385個、桃赤色桿菌240個、判定不能15個で、合計640個であった。

総菌体数に対するグラム陽性率は60.2%、グラム陰性率は37.5%、判定不能率は2.3%であった。判定可能な菌体だけで計算した陽性割合は61.6%であった。

球菌の平均直径は0.94 µm、桿菌の平均長径は2.20 µm、平均短径は0.74 µmであった。桿菌の縦横比は約2.97であった。

既知の陽性・陰性対照標本は、それぞれ青紫色と桃赤色に染まり、染色工程は概ね適切であった。

本実験では、グラム染色によって教育用細菌標本の染色性、形、配列を観察した。

試料Aでは青紫色の球菌が房状に認められたため、グラム陽性球菌と判定した。グラム陽性菌は厚いペプチドグリカン層を持ち、一次染色と媒染によって形成された色素複合体を脱色後も保持しやすいため、青紫色に観察されたと考えられる。

試料Bでは桃赤色の短桿菌が観察されたため、グラム陰性桿菌と判定した。グラム陰性菌では、脱色によって一次染色の色素が抜け、その後の対比染色によって桃赤色に染まったと考えられる。

試料Cでは、青紫色の球菌と桃赤色の短桿菌が同一標本内に認められた。この結果は、グラム陽性球菌とグラム陰性桿菌の混合標本であることと一致した。

10視野で計数した結果、紫色球菌385個、桃赤色桿菌240個、判定不能15個であった。総菌体数に対するグラム陽性率は60.2%、陰性率は37.5%、判定不能率は2.3%であった。

判定可能な菌体だけを用いると、陽性割合は61.6%となった。判定不能菌体を除外するか含めるかによって割合が変わるため、結果には計算方法を明記する必要がある。

陽性菌と陰性菌の比は約1.60：1であり、混合標本中では陽性球菌の方が多かった。ただし、この割合が元の混合比と完全に一致するとは限らない。

標本作製時に菌体が均一に分散していない場合、視野によって陽性菌と陰性菌の割合が変化する。また、球菌が房状に集まっている場合は、個々の細胞境界が不明瞭となり、計数誤差が生じやすい。

球菌は主に房状に配列していた。これは、細胞分裂後に菌体同士が完全に離れず、複数方向に分裂した細胞が集団として残ったためと考えられる。

短桿菌は単在または短い連鎖として観察された。球菌と桿菌では形態だけでなく、分裂面や分裂後の離れ方にも違いがあり、それが配列に反映されたと考えられる。

球菌の平均直径は0.94 µm、桿菌の平均長径は2.20 µm、平均短径は0.74 µmであった。桿菌の縦横比は約2.97であり、長径が短径のおよそ3倍であった。

ただし、顕微鏡像から求めた菌体サイズには、倍率補正、焦点、輪郭の判定、菌体の向きなどによる誤差が含まれる。特に桿菌が観察面に対して斜めに存在すると、実際より短く見える場合がある。

グラム染色で最も重要な誤差要因は脱色条件である。脱色が不足すると、グラム陰性菌に一次染色の色が残り、紫色に見える偽陽性が増える。

参考値では、脱色不足条件で陰性対照の桃赤色率が61%まで低下した。これは、陰性菌の一部が紫色に残ったためであり、グラム陽性菌として誤判定される可能性を示す。

一方、脱色が過剰になると、グラム陽性菌からも色素複合体が失われ、対比染色によって桃赤色に見える偽陰性が増える。

過剰脱色条件では、陽性対照の紫色率が71%まで低下した。既知の陽性菌100個中29個が陰性様に見えたとすると、偽陰性率は29%となる。

したがって、グラム染色では、脱色時間だけでなく、脱色液の量、流し方、標本の厚さを統一する必要がある。同じ時間であっても、厚い塗抹と薄い塗抹では脱色の進み方が異なる。

塗抹が厚すぎると菌体が重なり、染色液や脱色液が均一に作用しにくい。また、背景が濃くなり、個々の菌体の色と形を判定しにくくなる。

固定不足では、洗浄中に菌体がスライドから脱落する可能性がある。反対に、固定が過剰であると、菌体が変形したり、細胞壁が損傷して染色性が変化したりする可能性がある。

判定不能菌体が2.3%認められた原因として、青紫色と桃赤色の中間色に見えたこと、菌体が重なっていたこと、焦点が不十分であったこと、背景色素の影響を受けたことなどが考えられる。

中間色の菌体を無理に陽性または陰性へ分類すると、陽性率と陰性率に人為的な偏りが生じる。そのため、判定基準を満たさない菌体は判定不能として別に記録する方が適切である。

複数観察者の判定一致率は90.0%であった。2標本で判定が異なった原因として、淡い紫色や赤紫色の解釈、背景の汚れ、菌体の重なりなどが考えられる。

観察者間の差を減らすには、既知対照の代表像を用いて判定基準を共有し、色、菌形、背景状態を総合して判断する必要がある。

また、既知のグラム陽性・陰性対照標本を同時に染色することは、染色工程が正しく行われたかを確認するために重要である。

陽性対照まで桃赤色になった場合は過剰脱色、陰性対照まで紫色に残った場合は脱色不足や塗抹過厚が疑われる。対照標本が予想どおりに染まらなければ、未知試料の判定も信頼できない。

グラム染色は、細菌を大きく分類し、観察方針を立てるために有用である。しかし、同じグラム反応と菌形を示す菌は多数存在するため、グラム染色だけで菌種を確定することはできない。

さらに、培養状態、細胞の老化、細胞壁の損傷などによって、通常とは異なる染色性を示すこともある。そのため、必要に応じてコロニー形態、生化学的性質、追加染色などの結果と組み合わせて解釈する必要がある。

以上より、試料Aはグラム陽性球菌、試料Bはグラム陰性桿菌、試料Cは両者の混合標本と判定された。正確な判定には、薄く均一な塗抹、適切な固定、適正な脱色、対照標本の使用、複数視野での観察が重要である。

すべての菌体が紫色になった原因として、脱色不足、塗抹が厚すぎたこと、脱色液が十分に作用しなかったことなどが考えられる。陰性対照まで紫色であった場合は、未知試料を陽性と判定することはできない。

すべての菌体が桃赤色になった原因として、脱色過剰、固定による細胞壁損傷、古い試料の使用、一次染色や媒染不足などが考えられる。陽性対照まで桃赤色であった場合は、染色工程の再確認が必要である。

同じ形の菌体が紫色と桃色の両方に見えた場合、脱色の不均一、塗抹の厚さの違い、菌体の老化や損傷、複数菌種の混在などが考えられる。位置ごとの塗抹状態と対照標本を確認し、必要に応じて再染色する必要がある。

菌体がほとんど見えなかった原因として、塗抹量が少なすぎたこと、固定不足により洗浄中に菌体が脱落したこと、観察位置や焦点が適切でなかったことなどが考えられる。

背景に結晶状の物質が多かった原因として、染色液の沈殿、洗浄不足、スライドの汚れなどが考えられる。結晶は細菌より大きく不規則であることが多いが、小さな沈殿は菌体と誤認される可能性がある。