遺伝子解析の考察例｜PCR・電気泳動・塩基配列・変異判定・誤差原因

植物由来3試料からDNAを抽出し、標的遺伝子領域をPCRで増幅した。試料A、B、CのDNA濃度は、それぞれ42.5、36.8、51.2 ng/µLであった。

試料AのA260/A280は1.82、A260/A230は2.03であり、PCRに使用可能な純度であると判断した。

電気泳動の結果、試料Aと試料Bには約520 bpの主バンドが認められた。試料Cには約700 bpのバンドが認められた。

陽性対照には予想された約520 bpのバンドが認められ、陰性対照には主バンドが認められなかった。

試料Aの増幅産物について塩基配列を解析した結果、472塩基を比較でき、そのうち468塩基が基準配列と一致した。配列一致率は99.15%であった。

塩基置換は3か所、1塩基欠失は1か所に認められた。

バンドパターンから、試料Aは短型ホモ接合、試料Bは短型と長型を持つヘテロ接合、試料Cは長型ホモ接合と推定した。

本実験では、DNA抽出、PCR、電気泳動、塩基配列比較を行い、試料間の遺伝的な違いを解析した。

試料AのDNA濃度は42.5 ng/µLで、A260/A280は1.82、A260/A230は2.03であった。

一般に、DNA試料のA260/A280が約1.8に近い場合、タンパク質混入が比較的少ないと考えられる。また、A260/A230が約2.0に近かったことから、塩や有機化合物の混入も大きくないと推定された。

ただし、吸光度比だけでDNAの完全性を判断することはできない。DNAが分解していても濃度と吸光度比が正常に見える場合があるため、電気泳動像も合わせて評価する必要がある。

PCR後の電気泳動では、試料AとBに約520 bpのバンドが認められた。これは、使用したプライマーで挟まれた標的領域が両試料に存在し、PCRが成立したことを示す。

陽性対照にも約520 bpのバンドが認められたため、PCR試薬、温度条件、電気泳動、染色の各工程はおおむね正常に機能したと考えられる。

陰性対照には約520 bpの主バンドが認められなかったため、試薬や操作環境への標的DNAの大きな混入はなかったと考えられる。

一方、陰性対照の約80 bp付近に微弱なバンドが認められた。これは、プライマー同士が結合して増幅されたプライマーダイマーである可能性が高い。

プライマーダイマーが強い場合は、プライマー濃度が高い、アニーリング温度が低い、プライマー配列同士に相補性があるなどの原因が考えられる。

試料Aでは約520 bpの主バンドに加えて、約250 bpの弱いバンドが認められた。このバンドは、プライマーが目的領域以外へ結合して生じた非特異的増幅産物である可能性がある。

非特異的バンドを減らすには、アニーリング温度を上げる、プライマー濃度やマグネシウム濃度を調整する、サイクル数を減らすなどの改善が考えられる。

試料Cでは約700 bpのバンドが認められ、試料AおよびBの約520 bpより長かった。

この差は、プライマーで挟まれた領域に約180 bpの挿入配列が存在する、または反復配列数が異なる可能性を示す。

試料Aが520 bpのみ、試料Bが520 bpと700 bp、試料Cが700 bpのみを示した場合、試料Aは短型ホモ接合、試料Bはヘテロ接合、試料Cは長型ホモ接合と推定できる。

ただし、1本のバンドしか見えない場合でも、片方の対立遺伝子だけが増幅されるアレルドロップアウトが起きている可能性がある。

そのため、遺伝子型を確定するには、反復測定、別のプライマー対、塩基配列解析などによる確認が望ましい。

DNAラダーの移動距離と断片サイズの常用対数を用いて計算したところ、試料Aの主バンドは約507 bpと推定された。

目視では約520 bpと判断されたため、計算値とおおむね一致した。両者の差は、バンド中心位置の測定、ゲルのゆがみ、ラダーの移動距離、回帰式の近似などによって生じたと考えられる。

塩基配列解析では、472塩基中468塩基が基準配列と一致し、一致率は99.15%であった。

一致率が高かったことから、試料Aの増幅産物は基準配列と同じ遺伝子領域に由来すると考えられる。

不一致は4塩基であり、そのうち3か所が一塩基置換、1か所が1塩基欠失であった。

一塩基置換が実際の遺伝的変異であるか、配列読み取りの誤りであるかを判断するには、波形データの品質、逆方向配列、反復解析を確認する必要がある。

配列末端付近では読み取り品質が低下しやすく、誤った塩基が割り当てられることがある。そのため、低品質領域を除外してから一致率を計算することが重要である。

1塩基の挿入または欠失がタンパク質をコードする領域内に存在する場合、読み枠がずれるフレームシフトを起こし、その後のアミノ酸配列が大きく変化する可能性がある。

一方、3塩基単位の挿入・欠失であれば、読み枠を保ったままアミノ酸が追加または欠失する可能性がある。

塩基置換についても、同じアミノ酸を指定する同義置換、異なるアミノ酸へ変わるミスセンス置換、終止コドンとなるナンセンス置換などがある。

したがって、変異の影響を評価するには、塩基配列の違いだけでなく、コドンとアミノ酸配列の変化も確認する必要がある。

試料間の配列一致率が高くても、短い領域だけでは近縁な生物種や系統を区別できない場合がある。

種同定や系統解析の信頼性を高めるには、複数の遺伝子領域を解析し、公開データベース中の信頼できる配列と比較することが望ましい。

今回の解析では、DNA濃度、純度、陽性対照、陰性対照、バンドサイズ、配列一致率を総合して評価した。

遺伝子解析では、目的バンドが得られたことだけで結論を出すのではなく、非特異的増幅、コンタミネーション、配列品質、基準配列の選択、反復性を確認することが重要である。

以上より、試料AとBには約520 bpの短型領域、試料Cには約700 bpの長型領域が存在すると推定された。

また、試料Aの塩基配列は基準配列と99.15%一致し、少数の塩基置換と欠失が認められた。

これらの結果から、試料間にはDNA断片長および塩基配列上の違いが存在し、遺伝子型の判定や系統間比較に利用できると考えられた。

目的バンドが得られなかった原因として、DNA濃度不足、DNA分解、PCR阻害物質の混入、プライマーの不適合、アニーリング温度の不適切さ、試薬添加ミスなどが考えられる。陽性対照の結果を確認し、DNA品質とPCR条件を再検討する必要がある。

陰性対照に目的サイズのバンドが認められた場合、試薬、ピペット、作業台、増幅済みDNAなどからのコンタミネーションが疑われる。この場合、試料の陽性結果も信頼できないため、作業環境を清掃し、新しい試薬で再実験する必要がある。

ゲル上にスメアが認められた原因として、DNA分解、鋳型DNA過剰、非特異的増幅、電圧過大、試料中の塩類混入などが考えられる。DNA量、PCR条件、精製状態、泳動条件を見直す必要がある。

配列一致率が低かった場合、異なる遺伝子領域を増幅した、基準配列が不適切であった、配列方向を取り違えた、低品質領域を含めた、挿入・欠失によってアラインメントがずれた可能性がある。逆相補配列と品質値を確認し、再度アラインメントする必要がある。

複数バンドが得られた場合、ヘテロ接合による異なる長さの対立遺伝子、非特異的増幅、複数コピー遺伝子、混合試料などが考えられる。バンドサイズ、強度、陽性対照、塩基配列を確認して原因を判断する必要がある。