電気泳動の考察例｜DNAバンド・移動距離・サイズ推定・スメア・誤差原因

教育用PCR産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動し、DNAラダーとの比較によって断片サイズを推定した。泳動条件は100 V、30分とした。

DNAラダーでは、1500、1000、700、500、300、200、100 bpに相当する基準バンドが確認された。陽性対照では、500 bpラダーバンドとほぼ同じ位置に明瞭な単一バンドが認められた。

陰性対照には明瞭なバンドは認められなかった。試料Aではウェルから35 mmの位置に主バンドが認められ、検量線から約516 bpと推定された。

試料Bでは約500 bpに弱い単一バンドが認められた。試料Cでは約500 bpの主バンドに加え、約300 bpの副バンドが認められた。試料Dでは明瞭な単一バンドは認められず、レーン全体にスメアが観察された。

試料Aの3反復における推定サイズは512、500、505 bpで、平均506 bp、標準偏差6.0 bp、変動係数1.2%であった。

本実験では、教育用PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、DNAラダーとの比較から断片サイズを推定した。

DNAはリン酸基によって負に帯電しているため、電場中では正極側へ移動した。アガロースゲル内部には網目構造があるため、小さいDNA断片ほど抵抗を受けにくく、大きい断片より遠くまで移動したと考えられる。

DNAラダーでは、1500 bpから100 bpまでの基準バンドがサイズの小さい順に遠くまで移動した。この結果は、DNA断片サイズと移動距離の間に負の関係があることを示す。

ただし、DNAサイズと移動距離がそのまま直線関係になるわけではなく、一定の範囲ではDNAサイズの常用対数と移動距離がおおむね直線関係を示す。

そのため、ラダーバンドの移動距離を横軸、DNAサイズの常用対数を縦軸として検量線を作成し、試料バンドのサイズを推定した。

試料Aの主バンドは35 mm移動し、検量線から約516 bpと推定された。予想サイズ500 bpに対する相対誤差は3.2%であり、概ね予想されたサイズと一致した。

推定値が理論値と完全に一致しなかった原因として、移動距離の読み取り誤差、バンド幅、ゲル濃度のばらつき、電圧や温度の影響、検量線の近似誤差などが考えられる。

バンドの移動距離は、ウェルのどの位置を基準にするか、バンドの上端・中央・下端のどこを測るかによって変化する。今回はウェル底からバンド中央までを測定したが、この基準をすべてのレーンで統一することが重要である。

陽性対照では約500 bpに明瞭な単一バンドが認められたため、電気泳動とDNA染色は正常に行われたと判断した。

陰性対照に明瞭なバンドが認められなかったことから、試薬や操作中の目的DNA汚染は確認されなかった。

試料Bでは約500 bpに弱いバンドが認められた。バンドが弱かった原因として、DNA量が少なかったこと、試料添加量が不足したこと、PCR増幅効率が低かったこと、染色や撮影条件の影響が考えられる。

試料Cでは、約500 bpの目的バンドに加え、約300 bpの副バンドが認められた。この副バンドは、PCRにおける非特異的増幅産物である可能性が高い。

非特異的バンドの原因として、PCR時のアニーリング温度が低かったこと、プライマー濃度が高かったこと、サイクル数が多すぎたことなどが考えられる。

試料Dではレーン全体にスメアが認められた。スメアの原因として、DNAの分解、試料量過多、複数サイズのDNA断片の混在、塩や不純物の混入、ゲルの過熱などが考えられる。

DNAが分解すると、さまざまな長さの断片が生じるため、単一位置へ集まらず、低分子側へ連続したにじみとして観察される。

また、試料量が多すぎる場合はウェル内やレーン内でDNAが過密となり、太いバンドやスメアが生じる可能性がある。

色素先端が65 mm、500 bpバンドが36 mm移動したため、相対移動度は0.554であった。相対移動度を用いると、泳動時間やゲル長が多少異なる場合でも、色素先端に対するDNAの位置を比較しやすくなる。

ただし、色素とDNAでは電荷や分子構造が異なるため、相対移動度だけでDNAサイズを直接求めることはできない。サイズ推定には同じゲル上のDNAラダーが必要である。

試料Aの3反復における推定サイズは512、500、505 bpで、平均506 bp、標準偏差6.0 bp、変動係数1.2%であった。

変動係数が比較的小さかったことから、移動距離の測定とサイズ推定には一定の再現性があったと考えられる。

一方、バンド強度の比較では、DNA量が増えるほど強度も増加したが、DNA量を2倍にしても強度は正確に2倍にはならなかった。

これは、DNA染色の飽和、撮影装置のダイナミックレンジ、背景補正などの影響により、バンド強度とDNA量の関係が高濃度域で直線から外れたためと考えられる。

したがって、バンド強度からDNA量を推定する場合は、既知量の基準バンドを複数用い、直線性が保たれる範囲で検量線を作成する必要がある。

ゲル濃度も分離結果へ大きく影響する。ゲル濃度が低いと網目が大きくなり、大きいDNA断片の分離に適する一方、小さい断片は速く移動しすぎて分離しにくい。

ゲル濃度が高いと網目が細かくなり、小さいDNA断片を分離しやすくなるが、大きい断片の移動は遅くなる。

今回の参考条件である1.5%ゲルは、100～1000 bp程度のDNA断片を比較するために比較的適していたと考えられる。

電圧が高すぎると、泳動時間は短くなるが、ゲルや緩衝液が発熱し、レーン中央と端で移動速度が変化することがある。その結果、バンドが湾曲したり、分離が悪くなったりする。

反対に電圧が低すぎると、分離は安定しやすいものの、泳動に長時間を要し、拡散によってバンドがぼやける場合がある。

電気泳動結果を正確に解釈するには、バンドの有無だけでなく、移動距離、推定サイズ、バンド数、濃さ、形状、スメア、対照試料の結果を総合して評価する必要がある。

以上より、試料AとBでは予想サイズ付近のDNA断片が確認され、試料Cでは目的断片と非特異的断片が混在し、試料DではDNAの分解または試料条件不良を示すスメアが認められた。

DNAがウェル側またはゲル外の反対方向へ移動した場合、電極の接続方向が逆であった可能性が高い。DNAは負に帯電しているため、ウェルを負極側に配置し、正極側へ移動させる必要がある。

すべてのバンドがほとんど移動しなかった原因として、通電されていなかったこと、電圧が低すぎたこと、緩衝液濃度が不適切であったこと、ゲル濃度が高すぎたことなどが考えられる。

バンドが曲がった原因として、高電圧による発熱、ゲルの厚さの不均一、緩衝液量の偏り、ウェル位置のずれなどが考えられる。電圧を下げ、水平な場所で均一なゲルを作製する必要がある。

バンドが薄すぎた原因として、DNA量不足、試料添加量不足、PCR増幅不足、染色不足、撮影時の露光不足などが考えられる。陽性対照とラダーの見え方を確認し、試料側と観察側のどちらに原因があるか検討する必要がある。

すべてのレーンがスメアになった場合、ゲルの過熱、緩衝液の調製不良、電圧過剰、DNA染色や撮影条件の問題が考えられる。個別試料ではなく泳動系全体の条件を確認する必要がある。