酵素活性の考察例｜反応速度・比活性・温度・pH・阻害・誤差原因

教育用酵素試料を用い、37℃、pH 7.0で酵素反応を行い、405 nmにおける吸光度変化を測定した。

ブランク補正後の吸光度は、0、1、2、3、4、5分でそれぞれ0.002、0.116、0.232、0.345、0.452、0.548であった。

0～3分の初期直線部分から求めた吸光度変化は0.114 A/minであった。生成物検量線y = 5.00x + 0.001を用いると、生成物濃度の増加速度は0.0226 µmol/mL/minであった。

反応液総量3.0 mL、酵素液添加量0.075 mLとして計算した酵素活性は0.90 U/mLであった。

タンパク質濃度が0.20 mg/mLであったため、比活性は4.50 U/mg proteinであった。

温度条件では37℃で最大活性0.90 U/mLを示し、60℃では0.20 U/mL、80℃では0.03 U/mLまで低下した。

pH条件ではpH 7.0で最大活性を示し、酸性側およびアルカリ性側では活性が低下した。

3反復の活性値は0.87、0.90、0.93 U/mLで、平均0.90 U/mL、標準偏差0.03 U/mL、変動係数3.3%であった。

本実験では、教育用酵素の反応に伴う生成物の増加を吸光度変化として測定し、酵素活性を求めた。

ブランク補正後の吸光度は、反応開始から3分までほぼ一定の割合で増加した。この区間では生成物量が時間に対して直線的に増加していたため、酵素反応の初速度を評価できる範囲であったと考えられる。

一方、3分以降は1分当たりの吸光度変化が0.107、0.096へ徐々に低下した。これは、反応の進行に伴って基質濃度が低下したこと、生成物が蓄積したこと、反応系が平衡へ近づいたことなどが原因と考えられる。

したがって、5分間全体の平均速度ではなく、0～3分の初期直線部分を用いて活性を計算する方が適切である。

初期の吸光度変化は0.114 A/minであり、生成物検量線から生成物濃度の増加速度は0.0226 µmol/mL/minと求められた。

反応液総量3.0 mLでは、1分間に0.0678 µmolの生成物が生じた。1 Uを1分間に1 µmolの生成物を生じる酵素量と定義すると、反応液中の活性は0.0678 Uとなる。

酵素液添加量0.075 mLで補正すると、酵素液1 mL当たりの活性は0.90 U/mLであった。

酵素活性は反応液中に加えた酵素量によって変わるため、異なる試料を比較するときは、酵素液量またはタンパク質量で補正する必要がある。

今回の酵素試料のタンパク質濃度は0.20 mg/mLであったため、比活性は4.50 U/mg proteinであった。

比活性は、試料中の総タンパク質1 mg当たりの酵素活性を表す。目的酵素以外のタンパク質が除かれると、一般に比活性は上昇するため、酵素精製の指標となる。

精製前の粗抽出液では比活性0.50 U/mg、精製画分では4.50 U/mgであったため、精製倍率は9.0倍であった。

この結果は、精製操作によって目的酵素の割合が増加したことを示す。一方、総活性は10.0 Uから3.6 Uへ減少し、活性回収率は36%であった。

精製に伴って総活性が減少した原因として、沈殿やろ過による損失、容器への吸着、精製中の失活、目的酵素を含む画分の取り残しなどが考えられる。

したがって、精製の評価では、比活性の上昇だけでなく、総活性と回収率も合わせて考える必要がある。

温度条件では、10℃から37℃まで温度上昇に伴って酵素活性が増加し、37℃で最大活性を示した。

低温では分子運動が小さく、酵素と基質が衝突する頻度が低いため、反応速度が遅かったと考えられる。

37℃を超えると活性は低下し、60℃では最大値の約22%、80℃では約3%となった。

高温では酵素タンパク質の立体構造が変化し、活性中心の形状が保てなくなったため、基質と結合しにくくなったと考えられる。

温度上昇は化学反応速度を高める一方で、酵素の熱変性も促進する。そのため、酵素活性はある温度までは増加し、それを超えると急激に低下する。

ただし、今回得られた37℃という値は、この酵素、反応時間、pH、基質濃度における見かけの至適温度である。測定時間が長い場合は熱失活の影響が大きくなり、見かけの至適温度が低くなる可能性がある。

pH条件では、pH 7.0で最大活性を示し、酸性側とアルカリ性側の両方で活性が低下した。

pHは、酵素の活性中心に存在するアミノ酸側鎖や基質の電離状態へ影響する。適切な電荷状態が保たれないと、酵素と基質の結合や触媒反応が進みにくくなる。

また、極端なpHでは酵素タンパク質の立体構造そのものが変化し、活性が失われる可能性がある。

基質濃度を0.10 mMから10.0 mMへ増加させると、初速度は0.12 µmol/minから0.88 µmol/minへ増加した。

低基質濃度では、基質濃度の増加に伴って酵素と基質の衝突頻度が増えるため、反応速度が大きく上昇した。

一方、高基質濃度では速度の増加が小さくなり、一定値へ近づいた。これは、多くの酵素分子の活性中心が基質で占有され、酵素量が反応速度を制限するようになったためと考えられる。

阻害剤を加えると、濃度の上昇に伴って活性が低下し、高濃度条件では阻害率80%となった。

阻害剤が酵素の活性中心や別の部位へ結合し、基質結合または触媒反応を妨げた可能性がある。ただし、今回のデータだけでは、競争阻害、非競争阻害などの阻害形式を特定することはできない。

阻害形式を検討するには、複数の基質濃度と複数の阻害剤濃度で初速度を測定し、反応速度の変化を解析する必要がある。

3反復の活性値は0.87、0.90、0.93 U/mLで、変動係数は3.3%であった。ばらつきが比較的小さかったことから、反応温度、時間、ピペット操作、吸光度測定には一定の再現性があったと考えられる。

ただし、酵素反応は反応開始直後から進行するため、基質添加から測定開始までの数秒の差も結果へ影響する。複数試料を測定するときは、試薬添加順序と測定開始時刻をそろえる必要がある。

また、酵素液を高濃度のまま用いると反応が速すぎて、測定開始前に吸光度が大きく変化する場合がある。その場合は、酵素液を希釈して直線的な吸光度変化が得られる範囲へ調整する必要がある。

酵素活性の測定値は、酵素そのものの量だけでなく、測定温度、pH、基質濃度、反応時間、緩衝液、補因子などの条件に依存する。

したがって、活性値を報告するときは、単位だけでなく、使用した基質、温度、pH、反応時間などの条件も明記することが重要である。

以上より、本条件における酵素活性は0.90 U/mL、比活性は4.50 U/mg proteinであり、37℃、pH 7.0付近で最大活性を示した。

正確な酵素活性評価には、反応初期の直線部分を使用し、ブランク補正、温度管理、pH管理、基質濃度、酵素量、反応開始時刻を統一することが重要である。

吸光度が反応開始直後から直線的に増加しなかった原因として、反応開始前に酵素と基質が接触していたこと、混合不足、酵素量過剰、基質不足、気泡などが考えられる。酵素液を希釈し、基質添加後すぐに混合・測定する必要がある。

加熱した酵素試料で活性が低下した原因は、熱によって酵素タンパク質の立体構造が変化し、活性中心が基質へ結合できなくなったためと考えられる。高温処理後に冷却しても構造が元へ戻らない場合、不可逆的な失活が起きたと判断できる。

ブランクにも大きな吸光度変化が認められた場合、基質の自然分解、試薬同士の反応、温度による発色、ブランクへの酵素混入などが考えられる。試料値から適切に差し引くとともに、ブランク組成を確認する必要がある。

精製後に比活性が上昇し総活性が低下した場合、夾雑タンパク質が除去され目的酵素の純度は上がった一方、精製操作中に一部の酵素が失われたと考えられる。精製成功の評価には、比活性、精製倍率、総活性、回収率を合わせて用いる必要がある。

低温条件で活性が低かったのは、酵素が変性したためではなく、分子運動が小さく酵素と基質の衝突頻度が低下したためと考えられる。低温処理後に適温へ戻して活性が回復する場合は、可逆的な速度低下であったと判断できる。